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免疫印跡法
更新時(shí)間:2019-05-07   點(diǎn)擊次數(shù):3687次

Western blot基本原理

在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體,然后用這種多肽的特異抗體來(lái)檢測(cè)。

Western blot的中文名稱是:蛋白質(zhì)印跡,也叫免疫印跡(immunoblotting)。是分子生物學(xué)中常用的三種印跡技術(shù)之一。目前*的該實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)明人為美國(guó)斯坦福大學(xué)的喬治·斯塔克(George Stark)。

Western blot——蛋白質(zhì)印跡

Southern blot——DNA印跡

Northern blot——RNA印跡

Western blot 優(yōu)點(diǎn)

高分辨率的電泳技術(shù)

特異敏感的抗原-抗體反應(yīng)

1-5ng中等大小的靶蛋白

Western blot應(yīng)用

目的蛋白的表達(dá)特性分析

目的蛋白與其它蛋白的互作

目的蛋白的組織定位

目的蛋白的表達(dá)量分析

Western blot 流程

一、蛋白樣品的提取

提取細(xì)胞中的蛋白多是利用將細(xì)胞裂解、破碎、使蛋白質(zhì)釋放的原理。其中裂解液應(yīng)該新鮮制備,加入少量的蛋白酶抑制劑以減少蛋白的降解,并且分裝凍存于-80℃,蛋白酶抑制劑的種類很多,要根據(jù)具體情況選擇。

目的:要獲得高豐度、高品質(zhì)的蛋白質(zhì),以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。

二、蛋白樣品的定量

Western blot作為一項(xiàng)半定量實(shí)驗(yàn)技術(shù),電泳前,必須盡量使各組之間總蛋白量基本一致;

蛋白質(zhì)總量不足可能妨礙對(duì)目的蛋白的鑒定; 蛋白質(zhì)含量太高則會(huì)使帶形扭曲,甚至?xí)绊懘穗娪痉椒ǖ姆直媪Α?/span>

目前常用比色法測(cè)定樣品蛋白的含量:Bradford法(考馬斯亮藍(lán)法)、Lowry法(Folin-酚試劑法)、BCA法等。

三、蛋白樣品的變性

1M Tris-HCl(pH6.8)

10 ml

1M  DTT

20 ml

SDS

4 g

甘油

20 ml

溴酚藍(lán)

0.2 g

總體積

100ml

全部配好分裝,-20℃凍存。

1:1比例與蛋白質(zhì)樣品混合,95100℃加熱515min,冰上冷卻后再上樣,上樣量一般為20-25μl,總蛋白量2050μg。

SDS

陰離子去污劑   變性劑

氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。

蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量,消除了不 同分子之間原有的電荷差異。

與強(qiáng)還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開(kāi),使蛋白質(zhì)分子線性化。

蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點(diǎn):

不連續(xù)的電泳緩沖體系。

SDS—蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時(shí),不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀的影響,而只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。

SDS聚丙烯酰胺凝膠配制及蛋白分離范圍

灌膠
灌制分離膠 隔絕空氣 灌制濃縮膠  插入梳子                 

四、電泳

加足夠的電泳液后開(kāi)始準(zhǔn)備上樣。(電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)測(cè)的小玻璃板。)用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品(Marker 5-10ul ;樣本:10 ul )。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。加樣太快可使樣品沖出加樣孔,若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí),進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次,以免交叉污染。

采用恒壓的方法:1.恒壓60V,至樣本跑過(guò) 濃縮膠;2.將電壓調(diào)至120V至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳,準(zhǔn)備進(jìn)行進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

五、轉(zhuǎn)膜

凝膠電泳結(jié)束后,將凝膠上分離的蛋白條帶通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至固相支持物上,常用的固相支持物有NC (硝酸纖維素)膜、尼龍膜及PVDF(聚偏氟乙烯)膜。

選擇膜的主要根據(jù)有:

1.膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力(也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量)

2.膜的孔徑(也就是攔截蛋白的大?。?/span>

3.不影響后續(xù)的顯色檢測(cè)(也就是適合用于所選顯色方法,信噪比好)

4.如果后繼實(shí)驗(yàn)有其他要求,比如要做蛋白測(cè)序或者質(zhì)譜分析,還要根據(jù)不同目的來(lái)挑選不同的轉(zhuǎn)移膜

濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)

轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備濾紙和1張轉(zhuǎn)印膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套,因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。轉(zhuǎn)膜前,轉(zhuǎn)印膜以及濾紙均需浸潤(rùn)在電轉(zhuǎn)液中活化15-20min(其中PVDF膜需在無(wú)水甲醇中活化30min后再浸潤(rùn)于電轉(zhuǎn)液中,且濾紙應(yīng)與膠和膜的大小一致)。

將玻板輕輕撬開(kāi),將凝膠剪裁后從玻板上移至電轉(zhuǎn)液中。從陰極到正極,按照三層濾紙   凝膠 轉(zhuǎn)印膜 三層濾紙的順序制成“三明治”(濕轉(zhuǎn)在三明治的兩側(cè)各加一層活化過(guò)的海綿,同時(shí)應(yīng)注意去除膜、凝膠和濾紙之間的氣泡)。

半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

六、轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)

轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5min(于脫色搖床上搖)。然后用水沖洗掉沒(méi)染上的染液就可看到膜上的蛋白,將膜晾干備用。

將凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色,觀察凝膠中的蛋白是否*轉(zhuǎn)至印跡膜上。

七、封閉,結(jié)合一抗,結(jié)合二抗。

封閉

為避免作為檢測(cè)試劑的特異性抗體與膜發(fā)生非特異性結(jié)合,使非特異性背景提高,需對(duì)膜上的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉處理。

5%脫脂奶粉或BSA(室溫孵育1h

Tween-20的作用:減少非特異性吸附,不影響抗體與抗原的結(jié)合。

一抗孵育

把膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中,根據(jù)膜面積以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液,搖床上平緩搖動(dòng),于室溫孵育1-2小時(shí)或4℃過(guò)夜。

回收一抗溶液,用TBST漂洗膜3次,每次10min。

二抗孵育

加入二抗,搖床上緩慢搖動(dòng),于室溫孵育1-2小時(shí)或4℃過(guò)夜。

TBST漂洗膜3次,每次10min

后用TBS漂洗膜2次,每次10min。

八、固相免疫檢測(cè)

利用ECL(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光)發(fā)光檢測(cè)目的蛋白。

ECL試劑采用氧化還原反應(yīng)的原理:

發(fā)光液AB分別是魯米諾和過(guò)氧化氫,在辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的催化作用下,魯米諾與過(guò)氧化氫反應(yīng)生成一種過(guò)氧化物,過(guò)氧化物不穩(wěn)定隨即分解,形成一種能發(fā)光的電子激發(fā)中間體,當(dāng)后者由激發(fā)態(tài)返回至基態(tài),就會(huì)產(chǎn)生熒光。

九、Western blot結(jié)果分析

目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差,所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。

內(nèi)參的選擇

內(nèi)參即是內(nèi)部參照,對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來(lái)說(shuō)一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白,它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定,一般要選擇一個(gè)在處理因素作用的條件下蛋白含量不會(huì)發(fā)生改變的蛋白作內(nèi)參。

內(nèi)參起著校正總蛋白上樣量的重要作用,只有在內(nèi)參條帶基本均勻一致的情況下,目的蛋白條帶出現(xiàn)的差異才有意義,表明的確是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的干預(yù)因素造成目的蛋白量的變化,而不是加樣誤差造成目的條帶含量的變化。

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