定量Q-PCR-ELISA檢測技術(shù)的相關(guān)原理講解
定量Q-PCR-ELISA檢測技術(shù)是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對PCR產(chǎn)物進行標(biāo)記跟蹤,實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進行分析,計算待測樣品模板的初始濃度??捎糜趍RNA、microRNA、lncRNA等基因表達量的檢測。
類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:
1.模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;
2.模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,在溫度降至55℃左右時,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合;
3.引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2-4分鐘,在一個由計算機控制的循環(huán)加熱器上經(jīng)過三十個循環(huán),就可以把原來的樣品地擴增了2的30次方倍。擴增產(chǎn)物的量可用下列公式表示:C=C0(1+P)n。
其中:C為擴增產(chǎn)物量,C0為起始DNA量,P為擴增效率,n為循環(huán)次數(shù)。
在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增,達到較高水平。因此,應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),在平臺期前結(jié)束反應(yīng),減少非特異性產(chǎn)物。到達平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。
每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸,DNA含量可增加一倍(理論上)。對于某些擴增片段很短的PCR反應(yīng),即使Taq酶活性不是*也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完成,因此可以改為兩步法,即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,以減少一次升降溫過程,提高了反應(yīng)速度。