更新時(shí)間:2024-09-26
外泌體電鏡可以直觀的看到粒子的形態(tài),因此可以用于鑒定外泌體的存在和完整性,但是包括支原體、鐵蛋白聚團(tuán)、聚乙二醇蛋白聚團(tuán)、溶酶體等的電鏡圖片與外泌體都十分相似,并且電鏡只能展示局部景象。因此,電鏡成像無(wú)法區(qū)分外泌體及形態(tài)相近的納米粒子,且不能反映樣品中的外泌體數(shù)量。
1、樣品制備:
收集外泌體樣品:收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液、生物體液(如血漿、尿液等)或組織液體(如腦脊液等),其中包含外泌體。
預(yù)處理:通常需要對(duì)樣品進(jìn)行初步處理,如離心去除細(xì)胞碎片和大顆粒物質(zhì)。
電鏡固定:
固定樣品:使用適當(dāng)?shù)墓潭▌ㄈ缥於?、冷凍固定等)將外泌體固定在其原來的狀態(tài)中,以保持其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。
洗滌:用緩沖液洗滌樣品,以去除過剩的固定劑。
2、脫水和浸透:
脫水:在一系列濃度遞增的乙醇溶液中,逐步將樣品中的水分脫除,以使樣品適應(yīng)后續(xù)的樹脂浸透。
浸透:使用合適的樹脂(如Epon、Araldite等)浸透樣品,使其在固化后具有適合電鏡觀察的硬度和清晰度。
3、樹脂包埋:
預(yù)埋:將浸透后的樣品置于埋脂盒中,加入適量的樹脂,并根據(jù)需要進(jìn)行定向。
固化:根據(jù)樹脂的不同,采用適當(dāng)?shù)臏囟群蜁r(shí)間進(jìn)行固化,使樣品堅(jiān)硬并固定在樹脂塊中。
4、超微切片:
準(zhǔn)備超薄切片:使用超薄切片機(jī),將樹脂塊切割成約60-90納米厚度的超薄切片。
收集切片:將切片收集在銅或金網(wǎng)格上,以便后續(xù)的電鏡觀察。
5、電鏡觀察:
雙重染色:通常首先使用重金屬鹽(如鈾酸和鉛酞)對(duì)切片進(jìn)行雙重染色,以增加對(duì)比度。
電鏡觀察:將樣品放置在透射電鏡中,利用電子束通過樣品,觀察外泌體的形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。
拍攝圖像:使用透射電子顯微鏡(TEM)或掃描電子顯微鏡(SEM)拍攝外泌體的高分辨率圖像。
外泌體電鏡觀察是一項(xiàng)復(fù)雜的技術(shù),需要在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)條件和步驟可能會(huì)因?qū)嶒?yàn)?zāi)康暮驮O(shè)備不同而有所變化。為了獲得高質(zhì)量的觀察結(jié)果,建議在進(jìn)行外泌體電鏡觀察時(shí)咨詢專業(yè)人士或參考相關(guān)文獻(xiàn)。
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